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什么是荧光定量PCR

发布时间:2020/09/24 点击量:

       

       荧光定量PCR又称qPCR,是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

荧光定量PCR的由来                                   
 

       2020年,一场突如其来的新冠疫情,让“核酸检测”这一疾病检测方法一夜间为大家所公知。它在这次疫情防控中发挥了重大作用,成为临床诊断的 “金标准”。而实时荧光定量PCR则是此次核酸检测的主要应用方法,用以检测、判定临床样本中是否含有新冠病毒。今天小编先带大家初步了解一下什么是实时荧光定量PCR。
       它的由来是这样的从20世纪90年代初开始,许多实验室开始致力于相对准确的定量PCR技术的研究。在这一过程中,应用较多的是半定量PCR技术。引入管家基因,通过电泳后比较目的基因和管家基因的产物相对量,得到起始模板在量的差异。随后,为了进一步提高定量的准确性,人们开始设想在PCR过程中加入荧光物质,荧光物质会参与到第一轮PCR循环中,随着循环的进行和产物的增加,检测到的荧光物质也在发生变化,从而通过对荧光物质的检测实现全程监控PCR进程,最终可以计算出初始的模板量。1993年Higuchi等人将这一设想付诸实现!它的定义是这样的实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
       

荧光定量PCR的原理

       它检测的原理是这样的原理,包括探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。探针法由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,而非探针类则简便易行。例如:
       1.SYBRGreenⅠ法:SYBRGreenⅠ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。特点:非特异性,需检测熔解曲线;单通道检测;使用方便,经济便宜;常用于实验室研究。
       2.TaqMan探针法:TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。特点: 特异性好;可以多通道检测;单独设计探针;价格较高;常用于临床检测。随着荧光检测PCR仪的商品化,实时荧光定量PCR进入了一个特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应和由计算机软件进行快速统计的全新时代,实现了PCR从定性或半定量到准确定量的飞跃。它的特点和优势是这样的
       1)特异性强:引物和探针的“双保险”,避免检测的假阳性。
       2)灵敏度高:分析PCR产物的对数期,自动化仪器收集荧光信号,避免了许多人为因素干扰。
       3)避免污染:全封闭反应,无须PCR后处理。
       4)实现定量:运用标准品获得标准曲线,结合Ct值进行准确定量。
       5)高效低耗:可实现一管多检。
       6)操作简便:在线式实时监测扩增结果,不必接触有害物质。
       7)快速:反应时间<1.5小时。

在分子生物学领域的研究应用

  1. 定量核酸浓度:传统方法是用琼脂糖凝胶电泳或者分光光度计测定核酸浓度,其结果不准确而且易污染,实时荧光定量PCR可以解决这些问题,它的准确性、灵敏度高且无污染,对一些传染性疾病进行定量分析、病原微生物和病毒含量检测,此项技术都是首选  。
  2. 研究基因表达:应用实时定量PCR技术可以对基因时间、空间表达水平差异进行比较。例如,对特定基因用物理、化学、药物等不同方法处理后的差异进行比较,为人们的科学研究提供依据  。
  3. 用于单核苷酸多态性(SNP)检测分析:人们对疾病的易感性和对同一种药物治疗同一种疾病的效果是有差异性的,遗传物质DNA的多态性RELP,STR,ABO血型和SNP是个体差异的遗传基础。SNP在人类基因组中广泛存在,是人类可遗传变异中最常见的一种,在遗传性疾病的研究中具有重要意义 。
  4. DNA甲基化检测:DNA甲基化是表观遗传学重要的标记信息,通过实时荧光定量PCR技术获得基因组甲基化水平数据对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义



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